在生物研究領域，對活體生物樣本進行高分辨率、長時間的光學三維成像，是探索生物微觀奧秘的關鍵手段。然而，生物組織對成像光子的強烈散射作用，使得高分辨率光學成像只能局限于樣本表層。多光子顯微成像技術雖憑借長激發波長和非線性激發特性，在深層成像上有所突破，但高激發功率和長曝光時間帶來的光損傷問題，嚴重制約了其在長時程成像中的應用。

為攻克這一難題，北京大學、國家生物醫學成像科學中心程和平 / 王愛民團隊研發出雙側雙光子顯微鏡（Duo-2P），相關成果以 “Dual-objective two-photon microscope for volumetric imaging of dense scattering biological samples by bidirectional excitation and collection”為題，發表于 Photonics Research。而北京維快光子的 930nm 飛秒激光器，在這一創新成果中發揮著不可或缺的重要作用。

?Duo-2P成像系統

針對組織切片、類器官、發育胚胎和小生物體等體積小、結構致密且高度散射的樣本特點，研究團隊構建了雙物鏡的雙側雙光子顯微鏡構型。在該顯微鏡系統中，正置與倒置的共振掃描雙光子顯微鏡對稱分布于樣本兩側，它們各司其職，分別負責對樣品一半體積進行成像。通過激光路徑切換及物鏡軸向步進運動，實現交替的逐層光柵掃描成像，最終合成完整的三維圖像數據。

? (a) Duo-2P原理示意圖。(b) Duo-2P的體積成像時序，上下側顯微鏡交替執行光柵掃描與物鏡步進，并由來自兩個顯微鏡的Z堆棧圖像結合得到樣本完整三維圖像。(c) Duo-2P的激發與熒光收集時序，上下側顯微鏡逐幀分時激發并同時對熒光信號進行收集。

在這一成像過程中，北京維快光子的 930nm 飛秒激光器展現出獨特優勢。其 930nm 的波長，與多光子顯微成像技術所需的長激發波長高度適配，能有效減少生物組織對激發光的散射，為實現更深層次的成像奠定基礎。飛秒級別的脈沖寬度，使得激光器在極短時間內釋放能量，降低了對生物樣本的熱損傷和光漂白效應，這對于長時程成像至關重要。

借助 930nm 飛秒激光器的助力，Duo-2P 取得了一系列令人矚目的成果。它成功將受限于信背比的極限成像深度擴展到兩倍以上。以樣品厚度為散射長度五倍的情況為例，與傳統落射雙光子顯微鏡相比，Duo-2P 在使用 930nm 飛秒激光器后，總激發能量降低了一個數量級，大大減輕了對生物樣本的光損傷。對側額外的熒光收集，配合 930nm 飛秒激光器穩定的激發性能，使得圖像質量顯著提升，尤其是在樣品深層，圖像信噪比最多可提高 1.4 倍。雙物鏡構型結合 930nm 飛秒激光器的高效激發，增加了成像體積，在低散射厚樣本的體積成像中，能夠實現厚度兩倍于物鏡工作距離的生物樣本的完整體積成像。

?Duo-2P中雙側激發與熒光收集的模擬計算。(a) 圖1(a)中虛線框內成像腔室放大示意圖。(b) Duo-2P與傳統雙光子顯微鏡在不同成像深度的激發光功率比較。(c) 在不同樣本厚度的體積成像時，Duo-2P與傳統雙光子的輸入能量之比。(d) 成像深度(D)和離焦距離(Δd)對熒光收集效率(η)的影響。(e)與對側熒光收集效率和熒光強度相關的信噪比增益計算結果。

研究團隊通過模擬計算及驗證實驗，深入分析了 Duo-2P 在厚散射樣本中的成像性能。利用與 Duo-2P 匹配的雙側成像腔室，結合 930nm 飛秒激光器穩定的激發光輸出，成功對高散射、密集標記的小鼠視交叉上核中數千顆神經元進行了連續 4 小時的鈣信號記錄。此前，在哺乳動物生物鐘時間編碼的研究中，Duo-2P 借助 930nm 飛秒激光器，完成了對近萬顆神經元跨晝夜的鈣活動成像記錄，為解析視交叉上核的時間編碼機制提供了有力的數據支持。

未來，搭載北京維快光子 930nm 飛秒激光器的 Duo-2P，有望在腦科學、發育生物學及類器官等生物學領域發揮更大作用，為相關研究提供關鍵的技術支撐，推動生命科學研究邁向新高度。

（北京大學未來技術學院博士生翟慕岳為論文第一作者，北京大學未來技術學院、國家生物醫學成像科學中心程和平教授與北京大學電子學院、國家生物醫學成像科學中心王愛民副教授為論文通訊作者。該成果得到國家自然科學基金與醫學科學創新基金的支持。）

延伸閱讀————————————————————————

930nm飛秒激光器在雙側雙光子顯微鏡成像技術中有什么獨特的優勢？

1. 
   

1. 波長適配減少散射

   930nm 的波長與多光子顯微成像技術所需的長激發波長高度契合。生物組織對成像光子的散射會嚴重影響成像深度，而該波長能有效減少生物組織對激發光的散射，為實現更深層次的成像提供了基礎，使得顯微鏡可以突破生物組織的限制，對樣本進行更深入的觀察。

2. 飛秒脈沖降低損傷

   飛秒級別的脈沖寬度是其重要優勢。極短的脈沖意味著在極短時間內釋放能量，相較于長脈沖的激光器，它能大大降低對生物樣本的熱損傷和光漂白效應。在對生物樣本進行長時程成像時，這種低損傷特性至關重要，能保證樣本在成像過程中的活性和穩定性，獲取更準確、更完整的成像數據。

   
   

3. 降低激發能量
   
   在雙側雙光子顯微鏡（Duo-2P）中，配合其獨特的構型，930nm 飛秒激光器使得總激發能量顯著降低。以樣品厚度為散射長度五倍為例，與傳統落射雙光子顯微鏡相比，使用該激光器的 Duo-2P 總激發能量降低一個數量級，在減少光損傷的同時，也提升了成像的效率和質量。

4. 提升成像質量和范圍

   930nm 飛秒激光器穩定的激發性能，結合 Duo-2P 的對側熒光收集功能，顯著提升了圖像質量。在樣品深層，圖像信噪比最多提高 1.4 倍。同時，在雙物鏡構型下，它還增加了成像體積，在低散射厚樣本的體積成像中，能實現厚度兩倍于物鏡工作距離的生物樣本的完整體積成像，擴大了成像的范圍和深度。

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